[논문 리뷰] Acid sphingomyelinase modulates anxiety-like behavior likely through toll-like receptor signaling pathway

*논문 정보

제목: Acid sphingomyelinase modulates anxiety-like behavior likely through toll-like receptor signaling pathway

저자: Huiqi Yuan, Yanan Xu, Hailun Jiang, Meizhu Jiang, Luofei Zhang, Shifeng Wei, Cao Li and Zhigang Zhao

학회명: Molecular Brain

게재연도: 2025.02

 

* 용어

sphingomyelinase: 스핑고미엘린 분해 효소

Cerebral blood flow (CBF): 뇌혈류

neurolipids: 신경계에서 중요한 역할을 하는 지질

sphingolipid(스핑고지질): 세포막을 구성하고 신호 전달에 관여하는 중요한 지질 분자군, 신경계에서 풍부하게 존재함

myelin(미엘린): 신경 섬유의 축삭을 싸는 지방성 물질 

cascade: 연쇄 반응

synaptogenesis: 시냅스 생성

anxiolytic behavior: 항불안 행동, 불안을 감소시키는 행동 양상

innate immune response: 선천 면역 반응

adaptive immune response: 후천 면역 반응

macrophage: 대식세포

 

Abstract

최근 연구에서 acid sphingomyelinase(Asm)의 비정상적인 활동이 조현병, 우울증과 같은 psychiatric disorders(정신 질환)에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 하지만, anxiety(불안) 조절에서의 Asm의 역할은 아직 불분명하다. 본 연구에서는 Asm-knockout (Asm KO) 생쥐를 사용하여 다양한 방법을 통해 Asm과 불안 사이의 관련성을 조사하고자 하였다. The behavioral results(행동 테스트 결과)는 Asm KO 생쥐가 증가된 anxiety-like behaviors(불안 유사 행동)을 보인다는 것을 나타냈다. Transcriptional profiling과 생물정보학 분석은 Asm KO 생쥐에서 Toll-like recpetor signaling pathway 관련 유전자인 Tlr1/2, Cd3, Cd4, Cd5, Cd86의 upregulation을 밝혀냈다. 불안 유사 행동을 조절하는 Asm의 역할에 대한 우리의 발견은 감정적 안정성 유지에 중요한 역할을 함을 시사하며, 불안 장애 치료를 위한 잠재적 타겟이 될 수 있음을 나타낸다. 

 

Introduction

불안장애는 가장 일반적인 정신질환이고, 과도한 공포 및 불안, 인지된 위험에 대한 회피를 특징으로 한다. 최근 몇 년간 불안장애의 유병률이 크게 증가하였다. 불안장애는 정신 건강 뿐만 아니라 뇌졸중, 당뇨병, 관절염, 폐질환과 같은 다양한 신체 질병의 위험 또한 높인다. 불안장애의 높은 유병률과 복잡성은 병태생리에 대한 깊은 이해를 얻기 위한 지속적인 연구를 필요로 한다. 

 

최근 몇 년간, neurolipids가 불안의 병태 생리를 이해하는 데에서 새로운 타겟으로 등장하였다. Sphingomyelin(SM)은 sphingolipids의 주요 종류인데, 뉴런의 초기 발달에 중요한 역할을 하고, synaptogenesis에 중요한 조절자 역할을 한다. 그 결과, Sphingomyelin metabolism의 변화가 신경계 질환의 발병, 진행과 관련되어 있다. 따라서 많은 연구들이 sphingomyelin metabolism과 신경계 질환 간의 상관관계를 밝히고자 하였다. 하지만, 불안 장애에 대한 포커스는 상대적으로 적은데, 몇몇 연구들이 SM이 불안 관련 행동과 관련이 있음을 밝혀낸 바가 있어서, 불안 장애에서 SM 대사가 미치는 영향에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

 

Sphingomyelin 대사에는 다양한 효소가 관여하는데, 그 중 ASM(acid sphingomyelinase)이 중요한 효소이며, 다양한 병리학적 과정과 염증에 관여한다. ASM과 다른 정신 질환과의 관련성에 관한 증거도 이미 존재하는데, 아직 불안에서의 ASM의 역할은 불분명하다. 

 

이러한 점들을 고려할 때, 불안 장애에서 ASM의 역할에 대한 추가적인 연구가 필요하므로, 본 연구는 다음과 같은 두 가지를 밝히고자 하였다.

1. Asm 결손 생쥐를 이용하여 불안 장애에서 Asm의 영향

2. RNA 시퀀싱과 생물정보학적 분석을 통해 Asm 관련 항불안 행동의 기저에 있는 핵심 유전자 규명

이는 결과적으로 불안 증상 조절을 위한 치료 전략 및 표적 개발에 기여할 수 있을 것이다. 

 

Materials and methods

Mice

- Asm-knockout (Asm KO) mice

- Genotyping(유전자형)은 PCR 분석에 의해 검증됨

- 생후 2달, 3달, 4달된 WT과 Asm KO mice

- gener-balanced designs

 

Behavioral tests

정서적 행동을 평가하기 위해 생후 2달~4달된 WT, Asm KO 생쥐를 대상으로 여러 행동 테스트를 진행하였다.(fig. 1)

Anxiety-like behavioral tests(불안 행동 테스트)인 OFT, NSFT, EPM을 차례대로 진행하고, 이어서 Depressive-like behavioral tests(우울 행동 테스트)인 FST, TST를 차례대로 진행하였다.

fig. 1: flowchart of emotional behavioral tests

 

Anxiety-like behavioral tests

Open field test (OFT) 

각 WT, KO 생쥐를 정육면체 영역에 10분동안 위치시키고, 자유롭게 영역을 돌아다니도록 둔다. 가운데 30x30cm 영역을 central area(중심 영역)라고 정의한다. 총 이동 거리, 중심 영역에서 머문 시간, rearing 시간(일어선 시간), grooming 시간을 측정하고, fecal pellets(대변 알갱이, 배출량) 또한 측정한다. 

 

Novelty-suppressed feeding test (NSFT)

생쥐를 테스트 이전에 하루 동안 굶기고, 사각형 영역의 코너 부분에 각 생쥐를 위치시킨 후, 영역의 중심에 음식을 위치시킨다. 그후, 생쥐가 음식을 먹기 시작할 때까지의 지연 시간(latency)을 측정한다. 

 

Elevated plus maze test (EPM)

디바이스는 2개의 open arms, 2개의 closed arms로 구성된다. 각 생쥐를 중심 사각형 영역에 위치시키고, 해당 미로를 5분동안 자유롭게 탐험하게 둔다. open, closed arms로의 진입 횟수와 머문 시간을 측정하였다. 

 

Depression-like behavioral tests

Forced swimming test (FST)

유리 실린더에 물을 채우고, 생쥐의 꼬리가 바닥에 닿지 않게 떠다니게 위치한다음, 6분동안 헤엄치게 유도한다. 그리고 마지막 4분동안 immobility time(움직이지 않는 시간)을 측정하였다. 움직이지 않는 시간은 활동적인 움직임의 부재를 나타내고, 이는 즉 생쥐가 더이상 안간힘을 쓰려고 하지 않는다는 것을 의미한다. 

 

Tail suspension test (TST)

생쥐를 거꾸로 매달고 꼬리를 테이프로 고정시켜서 마찬가지로 6분동안 진행하고, 마지막 4분 동안 immobility duration(움직이지 않는 시간)을 측정하였다. 

FST와 TST모두 호흡을 하기 위한 움직임은 측정에서 제외하였다.

 

Cerebral blood flow (CBF) measurement (뇌혈류 측정)

생취 마취를 진행한 다음 두개골을 1cm정도 절개하고 laser speckle blood flow imager로 두개골을 통한 뇌혈류를 실시간으로 모니터링한다. 이렇게 나이가 다른(month 차이) WT, KO 생쥐의 뇌혈류를 측정하였다. 

 

Brain tissue preparation

행동 테스트와 CBF 측정 이후, 생쥐 마취를 진행하고 뇌 조직을 적출하였다. 전전두엽 수준(prefrontal cortex)에서 관상 단면(coronal sections)을 면역조직화학염색을 위해 추가적으로 처리하였다. 

 

RNA-seq

먼저, 총 RNA를 Total RNA Extractor를 이용하여 전전두엽에서 추출하였다. Illumina Hiseq platform을 통해 시퀀싱을 진행하고, FastQC를 통해 시퀀싱 데이터의 품질을 평가하였다. Trimmomatic을 통해 raw reads의 필터링을 진행하고, HISTA2를 이용하여 쥐 레퍼런스 genome에 정렬하였다. 유전자 발현 수준은 StringTie을 통해 정량화하였고, TPM(Transcripts Per Million)으로 유전자 길이, 시퀀싱 간 차이를 정규화, 보정하였다. DESeq2를 사용하여 WT, ASM KO 생쥐 간 DEGs(차등발현유전자)를 찾아내었고, 이때 조정된 p-values인 q-value<=0.05, log|2FoldChange|>=1 기준을 사용하였다. 

 

Bioinformatics Analysis of DEGs

DEGs를 더 자세히 분석하기 위해 Gene Ontology (GO) enrichment, KEGG enrichment, PPI(protein-protein interaction network)를 수행하였다. 

- GO enrichment: GO database 사용 https://geneontology.org

- KEGG enrichment: KEGG database 사용 https://www.kegg.jp 

- PPI network: STRING databse 사용 https://string-db.org

 

q-PCR

전체 RNA를 역전사 시킨 후에 qPCR을 진행하였다. Table 1에는 primer sequences가 나와있다.

table 1. the primer sequences: Gadph는 endogeneous 대조 유전자(비교 기준이 되는 유전자), 한 gene 당 두개의 primer(forward, reverse)가 존재

 

Immunohistochemistry staining (면역 조직 화학 염색)

전전두엽 슬라이스를 antigen retrieval(항원 회복) 과정을 거치고, 1차 항체(primary antibody)와 하룻밤동안 반응을 하고, 2차 항체(secondary antibodies)와 30분씩 두 번 반응을 진행한다. 해당 조직 슬라이스는 세포핵을 염색하기 위해 hematoxylin(헤마톡실린)으로 대조염색을 하였다. 

 

Statistical analysis

그룹 간의 차이는 t-test를 통해 평가하였고,  이때 pvalue<=0.05 기준을 사용하였다. RNA-seq 데이터 분석에서는 q-value(adjusted p values)<=0.05를 통계적으로 유의미한 기준으로 사용하였다. 

 

Results

Increased anxiety-like behaviors in asm KO mice

불안 유사 행동에 Asm이 어떻게 관여하는지 알아보기 위해, 불안 행동 테스트(anxiety behavioral tests: OFT, NSFT, EPM)들을 차례로 진행하였다. OFT를 먼저 진행하였는데, Asm KO 생쥐는 활동 흔적(위 그림)과 총 거리(아래 그래프)가 WT에 비해 유의미하게 감소하였고, 중심 영역에 머문 시간 또한 감소하였다.(fig. 2A)

fig. 2A

또한, rearing 시간(fig. 2B)과 grooming 시간(fig. 2C)도 KO 생쥐에게서 감소하였다. 

fig. 2B, C

fecal pellet 수는 WT와 KO 생쥐 간 유의미한 차이가 없었다.(fig. 2D)

fig. 2D

⇒ 자발적 활동(spontaneous activity) 및 탐색 행동(exploratory behavior)의 감소

⇒ 즉, Asm KO 생쥐의 불안이 증가하였음을 의미한다.

 

다음으로, NSFT 테스트를 진행하였다. 그 결과, WT 생쥐에 비교하여, KO 생쥐는 유의미한 delayed latency를 보였다. 또한, 해당 delay는 나이가 증가함에 따라 증가하였다.(fig. 2E)

 

fig. 2E

 

마지막으로, EPM 테스트를 진행한 결과, Open arm에서 머문 시간은 두 집단 간에서 유의미한 차이를 보이지 않았다.(fig. 2F) Open arm에 진입한 횟수 또한 두 집단 간의 유의미한 차이를 보이지 않았다.(fig. 2G)

fig. 2F,G

⇒ 종합적으로, Asm KO 생쥐는 증가된 불안 유사 행동을 보인다.

 

다음으로, 이제는 depressive-like behavior(우울 행동)에 Asm이 미치는 영향을 보고자 하였다. (이 부분은 Fig. S1~2참고)

TST에서 특히 생후 3, 4달 된 Asm KO 생쥐는 immobility에서 유의미한 감소를 보였다. FST에서도 생후 4달 된 WT, Asm KO 생쥐 간의 상당한 차이가 관찰되었다. 이처럼 Asm KO 생쥐가 WT에 비해 우울 유사 행동이 감소한 것을 보였지만, 여기서 짚고 넘어가야 할 점은 WT 생쥐가 우울증 모델이 아니었다는 점이다. 따라서, ASM의 결손은 병리학적 조건에서의 우울 유사 행동 감소를 의미하는 것이 아니고, 정상적인 생리 상태 하에서 우울 유사 행동을 부분적으로 완화하는 효과가 있음을 의미한다. 

 

 

Reduced cerebral blood flow in asm KO mice

선행 연구는 뇌 혈류의 변화가 불안과 관련이 있다는 것을 밝힌 바가 있다. 따라서, 본 연구에서 WT, Asm KO 생쥐 간 CBF(뇌 혈류) 차이를 분석하고자 하였고, 그 결과 KO 생쥐에서 CBF의 점진적인 감소, 특히 나이가 증가함에 따라 WT와의 CBF 차이가 커짐이 관찰되었다.(fig. 3) 

fig. 3

 

Alternations in mRNA expression profiling in the prefrontal cortex following asm KO

생후 4달 된 WT, KO 생쥐에서 전전두엽 영역에서 transcriptomics 분석을 진행하였다. fig. 4A는 전체적인 유전자 발현 분포를 나타내는 히트맵이다. 총 240개의 DEG가 발견되었고, 194개가 KO 생쥐에서 up-regulated, 46개가 down-regulated되었다.(fig. 4B)

⇒ Asm knockout이 prefrontal cortex에서 gene expression profiling을 변화시켰고, 이는 이러한 DEG들이 불안 발달에 관여할 잠재적인 가능성을 시사한다. 

 

fig. 4

 

Identification of key genes associated with anxiety-like behaviors induced by asm KO

GO database는 유전자 기능을 세개의 컴포넌트로 나눈다: Cellular Component(CC), Molecular Function(MF), Biological Process(BP)

240 DEGs에 대해 GO enrichment 분석을 수행한 결과, 이들 유전자가 BP 범주의 98개 GO 항목에 유의미하게 풍부하게 분포되어있음을 확인하였다. 이들 항목은 대부분 면역 시스템과 관련되어 있었다(fig. 5A). 또한, MF 범주의 오직 1개 GO 항목, 즉 Toll-like receptor binding에 유의미하게 풍부하게 분포되어있음을 확인하였고, CC 항목은 풍부도가 관찰되지 않았다. 

 

fig. 5A: Signi Num은 해당 GO term에 속한 유전자들 중, DEG에 포함된 유전자 수; Rich factor는 (DEGs중 해당 GO term에 속하는 유전자 수)/(전체 유전자 중 해당 GO term에 속하는 유전자 수)

 

240 DEGs를 대상으로 KEGG enrichment 분석을 진행한 결과, 6개의 KEGG pathways에서 유의미한 풍부도를 관찰할 수 있었다. 그 중 4개의 pathways가 면역 시스템과 관련이 있었고, complement and coagulation casades, Toll-like receptor signaling pathway, hematopoietic cell lineage, B cell receptor signaling pathway를 포함한다. 

 

fig. 5B

 

이들 경로에는 총 23개의 관련 유전자가 annotation되어 있다.(fig. 5C) 이러한 발견은 Asm KO에 따른 면역계 신호 전달의 이상이 쥐의 불안 유사 행동과 상관관계를 가질 수 있음을 시사한다. 

fig. 5C

Asm KO에 의해 유도되는 불안 유사 행동에 관여하는 핵심 면역 관련 유전자를 탐색하기 위해 KEGG 분석에서 유의미하게 풍부화된 면역계 관련 경로에 속하는 DEGs를 기반으로 PPI networks를 구성하였고, 허브 유전자(hub genes)를 분석하였다.(fig. 5D) 그 결과, Cd86, C1qa, Tlr2 등의 유전자가 상위 랭크되어, 이들이 면역 신호 전달 경로 네트워크에서 중심적인 역할을 할 가능성을 나타냈다. 또한, Toll-like receptor signaling pathway에 속하는 유전자들이 높은 순위를 보였으며, 여기에는 Tlr1, Tlr2, Ccl3/4/5, Cxcl9, Cd86가 포함되었다. 이에 따라, Toll-like receptor signaling pathway가 Asm KO에 의해 유도된 불안 유사 행동의 기저 기전으로 작용할 가능성이 있음을 제시한다. 

fig. 5D: 원의 크기는 연결된 상호작용의 수, 색상은 상호작용 수준

Verification of the mRNA levels of key genes

RNA-seq 데이터를 검증하기 위해, q-PCR를 통해 Toll-like receptor signaling pathway에서 enriched된 7개의 유전자(Tlr1, Tlr2, Ccl3, Ccl4, Ccl5, Cxcl9, Cd86)를 분석하였다. 그 결과, mRNA expression levels를 비교했을 때, WT에 비해 KO 생쥐에서 Cxcl9를 제외한 다른 6개의 유전자들이 모두 유의미하게 발현이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. (Cxcl9 또한, 증가했지만, 유의미한 차이가 아니었다.) (fig. 6)

⇒ Asm KO에 의해 유도된 불안 유사 행동에서 Toll-like receptor signaling(신호전달경로)이 활성화되었다. 

fig. 6

 

Activated immune response and inflammation in asm KO mice

Toll-like receptor signaling은 선천면역 및 후천면역 반응을 활성화하는 데 관여하며, 염증 관련 질환에서 핵심적인 역할을 수행한다. 대식세포는 선천, 후천 면역 모두에 관여하는 대표적인 면역세포로, 신경계 내에서는 microglia(미세아교세포)가 대식세포의 특수 subtype으로 기능한다. Asm KO가 면역 반응 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위해, microglia의 특이적 표지자인 iba-1을 분석하였다. fig. 7A에서와 같이, Asm KO 생쥐는 WT에 비해 iba-1 양성 세포(iba-1+ positive cells)가 유의미하게 증가하였다. 

fig. 7A

 

KO 생쥐에서 microglia의 형태 변화도 동시에 관촬되었는데, Asm 결손 이후 microglia의 soma 크기(세포체 크기)가 증가하였으며(fig. 7B), 전체 돌기 길이는 감소하였고(fig. 7C), 돌기 말단 수도 감소하였다.(fig. 7D) 이는 microglia의 활성화를 의미한다. 

fig. 7B~D

 

Astrocyte는 신경계에서 면역 보조세포로 기능하며, microglia에 의해 활성화되고 염증 반응에 협력한다. GFAP는 astrocyte의 반응성과 염증 상태를 나타내는 대표적인 표지자로, KO 생쥐에서 GFAP 양성 astrocyte 수 역시 유의미하게 증가하였다.(fig. 7E)

fig. 7E

⇒ Asm 결손에 의해 유도된 불안 유사 행동이 활성화된 면역 반응 및 염증과 연관되어 있음을 시사한다. 

 

Discussion

*Discussion이 너무 길어서 요약으로 대체

 

<연구 배경>

Asm의 비정상적인 활성은 다양한 정신질환과 연관되어 있지만, 불안의 병태생리에서의 구체적인 역할은 아직 명확히 규명되지 않았다.

 

<행동 테스트 결과>

OFT(Open Field Test), NSFT(Novelty Suppressed Feeding Test), EPM(Elevated Plus Maze)를 통해 Asm KO 마우스가 불안 유사 행동을 나타냄을 확인하였다.
OFT와 NSFT에서는 불안 증가 지표가 뚜렷했지만, EPM에서는 유의한 차이가 없었다. → 불안 행동 측정은 다차원적이며, 실험 간 결과 불일치는 일반적 현상이다.

 

<뇌혈류(CBF)분석>

Asm KO 마우스는 CBF가 유의하게 감소하였고, 기존 문헌에서도 불안 수준과 CBF 감소 간 연관성이 보고되었다. 이는 뇌허혈에 따른 글루탐산 과활성, 신경세포 사멸, 신경교세포 활성화 등이 관련 기전일 수 있다. 또한, Asm이 혈관 평활근세포의 수축 표현형에 영향을 미쳐 CBF를 조절할 가능성이 제시되었다.

 

<우울 유사 행동과의 비교>

FST(Tail Suspension Test), TST(Forced Swim Test)에서 Asm KO 마우스는 오히려 우울 유사 행동이 감소되었다. 
단, 대조군이 질병 모델이 아니었기 때문에 병적 개선이라고 보기는 어렵다. → 정상 생리 상태에서의 정서 변화로 해석할 수 있다.

 

<전사체 분석>

전전두엽(PFC)에서의 RNA-seq 결과, 총 240개의 DEGs (194 upregulated, 46 downregulated)를 확인하였다. 
특히 Ly9, Cd22, Ccl3, Cxcl9, Clec7a, Lyz2 등 면역 관련 유전자가 upregulated었다. 일부는 신경퇴행질환과도 연관되어 있다.

 

<GO/KEGG 분석>

대부분의 DEGs가 면역 반응, 방어 반응, 염증 관련 경로에 풍부하게 포함되었다. 
특히 Toll-like receptor (TLR) 경로, 보체/응고 연쇄, B세포 수용체 경로 등이 포함되었다.

 

<핵심 유전자 및 PPI 분석>

PPI 네트워크 분석 결과, Tlr1, Tlr2, Cd86, Ccl3/4/5, Cxcl9 등이 핵심 노드로 확인되었다.
qPCR에서도 해당 유전자 발현 증가가 확인되어 TLR1/2 경로 활성화가 핵심 병리기전으로 제시되었다. 

 

<염증 관련 기전>

microglia(iba-1) 및 astrocyte(GFAP)의 활성화가 면역반응 및 신경염증 증가를 뒷받침한다.
또한, TLR1/2 경로 하류에서 발현되는 케모카인 Ccl3, Ccl4, Ccl5, 염증 매개인자 Cd86도 유의하게 증가하였다.

 

<TLR1/2 관련 문헌 근거>

여러 선행 연구에서 Tlr1/2의 발현 증가가 스트레스, 불안, 염증성 신경 손상과 관련됨이 보고되었다.
Asm 결손에 따른 스핑고지질 축적 및 리포독성(lipotoxicity)이 TLR 경로를 활성화할 수 있음이 가설로 제시되었다.

 

<신경면역학적 해석>

불안 및 우울은 면역 시스템과 밀접하게 연관되며, 신경염증과 정서 상태 변화는 서로 영향을 주고받는 관계이다.
흥미롭게도, Asm KO는 염증을 유도하면서도 우울 유사 행동은 감소시켰다. → 보상 경로나 신경재생 경로 활성 가능성(p38K 경로 등)이 제시되었다.

 

<한계점>

1. 전신적 Asm 결손 마우스를 사용하여, 특정 세포 유형에서의 영향을 분리하기 어렵다. → 조건부 KO 모델 필요

2. Asm이 Tlr1/2 발현을 어떻게 조절하는지에 대한 직접적인 기전은 추가 연구가 필요하다. 

 

<결론>

Asm KO 마우스는 불안 유사 행동 증가와 신경염증 활성화를 보였으며, 이는 Tlr1/2 경로 및 하위 염증 매개체 활성화와 관련되었다.
Asm은 불안 장애 치료를 위한 잠재적 치료 타겟이 될 수 있음을 시사한다.